Πώς να προετοιμάσει ένα Drop Κρεμαστά

Για τον προσδιορισμό της 3D δομή μιας πρωτεΐνης , θα πρέπει πρώτα ένα καθαρό κρύσταλλο από αυτό . Η μέθοδος κρέμονται -drop χρησιμοποιεί μια σταγόνα που περιέχει πρωτεΐνη διάλυμα κρέμεται από μία καλυπτρίδα. Κάτω από αυτό κρέμεται σταγόνα βρίσκεται μια δεξαμενή με μια υψηλότερη συγκέντρωση άλατος από εκείνη της σταγόνας. Πάροδο του χρόνου, οι υδρατμοί αφήνει την πτώση και καταλήγει στο δοχείο , προκαλώντας την πρωτεΐνη να κρυσταλλωθεί. Κάθε πρωτεΐνη απαιτεί διαφορετικές συνθήκες ( όπως η συγκέντρωση άλατος και pH ) , και συχνά δοκιμής και λάθους προσφέρει ο μόνος τρόπος για να βρείτε τα σωστά conditions.Things Θα πρέπει
παλτό εργαστηρίου , γάντια και συσκευή προστασίας ματιών
Μικροπροχοΐδα με πιπέτα συμβουλές
1 molar διάλυμα χλωριούχου νατρίου σε 0,05 γραμμομόρια οξικού ρυθμιστικού διαλύματος , ρΗ 4,7
2 mL σωλήνες Eppendorf ( ή παρόμοιο)
Φυγόκεντρος
24 - φρεατίων
κενού γράσο σε σύριγγα
σιλικόνη καλυπτρίδα
πεπιεσμένου αέρα
Λαβίδες
Clay ( π.χ. πλαστελίνη ή παρόμοια )
50 mg /mL λυσοζύμη σε 0,05 ρυθμιστικό διάλυμα οξικού μοριακή , pH 4,7
Η Εμφάνιση Περισσότερες οδηγίες

1

Βάλτε σε εργαλεία εργαστηρίου ( παλτό , γάντια και προστασία για τα μάτια ) . 2

Χρησιμοποιήστε μικροσιφονίου να προσθέσει 1,1 mL από ένα διάλυμα χλωριούχου νατρίου ( αλάτι ) και οξικού ρυθμιστικού διαλύματος σε ένα σωλήνα Eppendorf .
εικόνων 3 <ρ> Φυγοκεντρήστε το κλειστό σωληνάριο Eppendorf με το διάλυμα άλατος μέσα σε αυτό για περίπου πέντε λεπτά στις 13.000 rpm. Θυμηθείτε να εξισορροπεί η φυγόκεντρος τοποθετώντας ένα άλλο σωληνάριο Eppendorf που περιέχει 1,1 ml ύδατος απέναντι από και απέναντι από τον σωλήνα διάλυμα άλατος.
Η 4

Προσθήκη 1 mL από το διάλυμα άλατος σε ένα φρεάτιο σε μια 24 φρεατίων πιάτο .
Η 5

Χρησιμοποιήστε μια σύριγγα πλήρωσης με γράσσο να τοποθετήσετε ένα λεπτό στρώμα γράσου γύρω από το χείλος του αυτό καλά . Προσέξτε να μην προσθέσετε πολύ λίγο ή πάρα πολύ . Εάν προσθέσετε πάρα πολύ λίπος, το λίπος θα τρέξει κάτω στο πηγάδι και , ενδεχομένως, να καταστρέψει το πείραμά σας . Αν χρησιμοποιείτε πολύ λίγο , το καλά δεν θα είναι στεγανοί και να το πείραμά σας δεν θα λειτουργήσει . Στόχος για αρκετό μόνο το λίπος που το επικάλυμμα και λίπη αποτελούν ένα αεροστεγές σφράγισμα αργότερα .
Η 6

Ανοίγουμε τον πηλό με τα χέρια σας για να κάνετε τέσσερις μικρές μπάλες και να τους ωθήσει επάνω στις τέσσερις γωνίες του 24- φρεατίων. Θα λειτουργήσει ως υποστηρίζει για να εξασφαλιστεί η κάλυψη της πλάκας δεν έρχεται σε επαφή με την καλυπτρίδα .
Η 7

Χρησιμοποιήστε πεπιεσμένο αέρα για να φυσήξει τη σκόνη μακριά από την καλυπτρίδα . Κρατήστε την καλυπτρίδα με ένα ζευγάρι των καθαρών τσιμπιδάκι .
8

Suck μέχρι 4 μικρολίτρα του διαλύματος λυσοζύμης με μικροπιπέττα σας , και να προσθέσετε αυτή τη λύση για το κέντρο της καλυπτρίδα . Αλλαγή ρύγχη πιπέτας , και προσθέστε 4 μικρολίτρα του διαλύματος άλατος . Πιπέτα πάνω και κάτω , το πιπίλισμα το υγρό στη συνέχεια αποβάλλει , να αναμίξετε το διάλυμα άλατος με το διάλυμα λυσοζύμης . Φροντίστε να συνδυάζουν και τα δύο , χωρίς διασπορά του υγρού σε όλη την καλυπτρίδα .
Η 9

Γυρίστε το καλυπτρίδα πάνω γρήγορα, ώστε το υγρό δεν γλιστρήσεις και φυτό ξεκάθαρα στην κορυφή της καλά . Φροντίστε να πιέσετε απαλά έτσι σχηματίζει ένα αεροστεγές σφράγισμα με το γράσο όλα γύρω από τις άκρες του καλά .
Η 10

Σπρώξτε το κάλυμμα της 24 - φρεατίων σε μπάλες από πηλό , και αφήστε η πλάκα σε ένα δροσερό μέρος .
εικόνων