Πώς να χρησιμοποιήσετε GSH επίπεδα στην ανίχνευση ROS

γλουταθειόνη ή GSH , είναι ένα μη ουσιώδες τριπεπτίδιο κατασκευασμένο από κυστεΐνη, γλουταμικό και γλυκίνη. Είναι ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό που προστατεύει τα κύτταρα και τα όργανα του σώματος σας από τις βλαβερές συνέπειες των ROS , ή αντιδραστικά είδη οξυγόνου , που σχηματίζονται από το μοριακό οξυγόνο , ως αποτέλεσμα διαφόρων μεταβολικών διεργασιών στο σώμα . Αντιοξειδωτικά, όπως η γλουταθειόνη , την εξουδετέρωση του ROS και τους εμποδίζουν να αλληλεπιδρά με και βλάπτουν το DNA και πρωτεϊνών στα κύτταρα σας. Η αναλογία των οξειδωμένη και ανηγμένη μορφή της γλουταθειόνης στο σώμα σας είναι ενδεικτική της ROS που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες σε body.Things σας , τι χρειάζεστε
Σύριγγα
βελόνα πεταλούδα
Φυγόκεντρος
ηπαρίνη νατρίου
Κατάψυξη
Sulfosalicylic οξύ
GSH Agent Αντίδραση
μικροπλακών
πηγή φωτός
πρότυπο διάλυμα GSH

Παρουσίαση Περισσότερες οδηγίες
Η 1

Ισοπαλία περίπου 2 ml αίματος με φλεβοκέντηση στο anticubetal φλέβα με μια βελόνα πεταλούδας 23 -gauge συνδέεται με μια σύριγγα 5 ml. Προσθέστε το δείγμα σε δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχουν ηπαρίνη νατρίου και αναποδογυρίστε απαλά το σωλήνα για την ανάμιξη.
Η 2

Συλλέξτε τα ερυθρά αιμοσφαίρια με φυγοκέντρηση του δείγματος στα 2500 στροφές ανά λεπτό για πέντε λεπτά . Ψύχεται και αποψύχεται το δείγμα τρεις φορές να σπάσουν τα κύτταρα . Φυγοκεντρήστε το διάλυμα κυτταρολύματος για 10 λεπτά στις 12000 rpm και 4 βαθμούς , και συλλογή του υπερκειμένου .
Εικόνων 3

Αφαιρέστε την πρωτεΐνη από το δείγμα με την προσθήκη 5 τοις εκατό σουλφοσαλικυλικό οξύ και φυγοκέντρηση του δείγματος σε 12.000 rpm για πέντε λεπτά στους 4 βαθμούς. Φυλάξτε το αποπρωτεϊνούνται υπερκείμενο στους -112 βαθμούς .
Η 4

Αναμίξτε ένα μέσο ανίχνευσης θειόλης , της γλουταθειόνης αναγωγάσης , νικοτιναμίδη δινουκλεοτιδικό φωσφορικό ρυθμιστικό δοκιμασίας και σε αναλογίες που υποδεικνύονται από τον κατασκευαστή του kit για να γίνει το μίγμα GSH . Το ποσό της κάθε χημική ουσία εξαρτάται από τον αριθμό των δοκιμών που σκοπεύετε να εκτελέσετε . Το μείγμα της αντίδρασης σε αραιό GSH 5 τοις εκατό σουλφοσαλικυλικό οξύ για να πάρετε συγκεντρώσεις 16 , 32 , 63 , 125 , 250 και 500 μικρολίτρα .
Η 5

Προσθήκη 1 έως 10 μικρολίτρα του δείγματος αίματος αποπρωτεϊνώθηκαν μέσα στα φρεάτια μιας μικροπλάκας . Προσθήκη σειριακά αραιωμένο πρότυπο διάλυμα GSH , η οποία είναι διαθέσιμη στο κιτ δοκιμής , σε κάθε φρεάτιο για να φέρει το συνολικό όγκο της κάθε φρεάτιο σε 10 μικρολίτρα .
Η 6

Προσθέστε 90 μΙ του μείγματος αντίδρασης GSH που έχετε κάνει στο Στάδιο 4 σε κάθε φρεάτιο στο μικροπλάκας. Αναμείξτε το αντιδραστήριο με την ανακίνηση του δίσκου για 30 δευτερόλεπτα .
Η 7

Μετρήστε την απορρόφηση αμέσως με την τοποθέτηση της πλάκας κάτω από το φως με μήκη κύματος 405 και 415 νανόμετρα . Επωάστε την πλάκα για 30 λεπτά . Πάρτε αναγνώσεις της απορρόφησης μετά από κάθε πέντε λεπτά κατά τη διάρκεια της επώασης .
8

Αραιώστε 6 χιλιοστομοριακό του επεξεργασμένου δείγματος με 5 τοις εκατό σουλφοσαλικυλικού οξύ και διάλυμα σουλφονικό trifluromethane . Αυτό θα αφαιρέσει όλη την μειωμένη GSH από το διάλυμα . Προσθέστε 1 έως 10 μικρολίτρα του διαλύματος αυτού στα φρεάτια της μικροπλάκας και επαναλάβετε τα βήματα 5 , 6 και 7 . Αυτό θα βοηθήσει να εκτιμηθεί η ποσότητα της οξειδωμένης γλουταθειόνης στο δείγμα .
Η 9

Σχεδιάστε την απορρόφηση και το δείγμα Οι συγκεντρώσεις σε ένα γράφημα για να ληφθεί η καμπύλη GSH τόσο για ανηγμένη και οξειδωμένη γλουταθειόνη. Υπολογίζεται η αναλογία μεταξύ των δύο μορφών της γλουταθειόνης . Αυξημένα επίπεδα οξειδωτικό επίπεδα γλουταθειόνης δείχνουν το οξειδωτικό στρες και ROS .
Η
εικόνων