Πώς να χρησιμοποιήσετε Sanger Αντιδραστήρια

αντιδραστήριο του Sanger χρησιμοποιείται για να βοηθήσει τον προσδιορισμό της αλληλουχίας των αμινοξέων που συνθέτουν ένα πεπτίδιο . Το αντιδραστήριο θα μάνταλο επάνω - ή ετικέτα - το αμινοξύ στο τέλος μιας πεπτιδικής αλυσίδας , επίσης γνωστή ως το Ν -τελικό άκρο. Το πεπτίδιο μπορεί στη συνέχεια να σπάσει σε κομμάτια ( υδρολύεται ) και τα μεμονωμένα αμινοξέα εξετάστηκε χρησιμοποιώντας διάφορες μεθόδους χρωματογραφίας . Όποιο αμινοξύ φέρει η ετικέτα είναι το ένα στο τέλος. Αντιδραστήριο του Sanger είναι επίσης γνωστή ως δινιτροφθοροβενζόλιο ( DNFB ) . Από τη στιγμή που έχει ασφαλισμένη στον ένα αμινοξύ , αυτό αναφέρεται ως DNP - compound.Things Θα πρέπει
εργαστηριακής κλίμακας
Γάντια
Προστατευτικά γυαλιά
Φυγόκεντρος
Φυγόκεντρος σωλήνες
σιφώνια Pasteur
αποσταγμένο νερό
4,2 % διάλυμα διττανθρακικού νατρίου
αντιδραστηρίου του Sanger ( FDNB )
pH χαρτί
διαιθυλαιθέρας
6Μ διάλυμα υδροχλωρικού οξέος
Ακετόνη
Test σωλήνα

Παρουσίαση Περισσότερες οδηγίες
Η 1

Ζυγίζονται 3 χιλιοστών του γραμμαρίου του πεπτιδίου σε μια κλίμακα . Τοποθετήστε το σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης . Προσθήκη περίπου 0,3 ml νερού , 0,3 ml Αντιδραστηρίου του Sanger και 0,075 ml όξινου ανθρακικού νατρίου.
Η 2

Αφήστε το φυγοκεντρικό σωλήνα για επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για μία ώρα . Κατά τη διάρκεια της επωάσεως , ο σωλήνας ανακινείται ελαφρά για να εμποδίσει το μείγμα από το διαχωρισμό . Ελέγξτε το ρΗ του διαλύματος ανά 15 λεπτά με χαρτί ρΗ . Το pH θα πρέπει να διατηρείται πάνω από 9 . Εάν αρχίζει να μειώνεται , προσθέστε μια μικρή ποσότητα διττανθρακικού νατρίου (περίπου μία σταγόνα με σιφώνιο Pasteur ) .
Εικόνων 3

Μετά την επώαση , προσθέστε 1.5 ml νερού και μία ίση ποσότητα αιθέρα. Αφήστε το διάλυμα να διαχωριστεί σε στοιβάδες . Μπορεί να χρειαστεί να φυγοκεντρείται το μίγμα για να διαχωρίζεται. Αφαιρέστε το στρώμα του αιθέρα ( η κορυφή, κίτρινο στρώμα) με ένα σταγονόμετρο και πετάξτε το .
Η

4 Ρυθμίστε το pH να μειωθεί σε 1,0 με αργή προσθήκη υδροχλωρικού οξέος. Προσθέστε ένα μικρό κομμάτι του οξέος σε έναν χρόνο , ανακατεύουμε απαλά , στη συνέχεια, ελέγξτε το pH με χαρτί pH . Συνολικά , θα πρέπει να απαιτούν περίπου 0,15 ml οξέος . Αν το pH πέσει κάτω από το 1,0 , προσθέστε μια μικρή ποσότητα ( όχι περισσότερο από μια σταγόνα ) του όξινου ανθρακικού νατρίου .
5

Προσθέστε 3 ml αιθέρα . Αφήνουμε το μίγμα να διαχωριστούν. Τώρα, το ανώτερο στρώμα ( το κίτρινο, το στρώμα αιθέρα ) περιέχει το DNP - ένωση . Χρησιμοποιώντας μια πιπέτα , εκχύλισμα προσεκτικά αυτό το στρώμα και το μεταφέρουμε σε ένα καθαρό δοκιμαστικό σωλήνα . Τοποθετήστε το δοκιμαστικό σωλήνα στην άκρη και αφήστε το υγρό να εξατμιστεί , αφήνοντας πίσω τους ένα ξηρό , κίτρινο στερεό .
Η 6

Πλύνετε τα στερεά σας με ακετόνη . Προσθήκη 0,3 χιλιοστόλιτρα ακετόνης , αναδεύεται ήπια και εκχύλιση του υγρού με μία πιπέττα . Προσθήκη 0,75 χιλιοστόλιτρα του οξέος στο δοκιμαστικό σωλήνα . Πεπτίδιο σας είναι τώρα με ετικέτα και είναι έτοιμο να υδρολύεται και αναλύθηκαν με τη μέθοδο της χρωματογραφίας της επιλογής σας .
Η
εικόνων