Πώς να δημιουργήσετε ένα πείραμα Μονοκατοικία Patch - Clamp

Το πείραμα επιθέματος χρησιμοποιείται για τη μέτρηση μεμονωμένων ζωντανών κυττάρων . Το κάνει αυτό με μια πολύ λεπτή πιπέττα πραγματοποιήθηκε στενά ενάντια μεμβράνης του κυττάρου και μόνο (το εξωτερικό προστατευτικό κάλυμμα ) . Το άνοιγμα αυτής της πιπέτας είναι μόνο περίπου 1 micron ( ένα χιλιοστό του χιλιοστού) και ελέγχεται οπτικά με μικροσκόπιο . Τα κύτταρα διατηρούνται ομοιόμορφες σε ένα πιάτο χρησιμοποιώντας ένα detacher κυττάρου, όπως η θρυψίνη . Ένα ειδικό κύτταρο επιλέγεται και το άκρο της πιπέτας τοποθετείται επί της κυτταρικής μεμβράνης . Μια σφιχτή σφραγίδα σχηματίζεται χρησιμοποιώντας αναρρόφησης και μέρος της μεμβράνης αναρροφάται μέσα στους pipette.Things Θα πρέπει
κυτταρικής πλάκας
Φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, ή PBS ( χωρίς ασβέστιο και μαγνήσιο)
Τρυψίνη
θερμοκοιτίδα
10 - χιλιοστόλιτρο πιπέτας
ΗΕΚ ( ανθρώπινα επιδερμικά keratinocyctes ) μέσο
εμβρυϊκό ορό μόσχου ( FCS )
Εξωτερικό λύση καταγραφής Φυγόκεντρος
σφιγκτήρα
Patch chip
Twist καπάκι
ηλεκτρόδιο

Παρουσίαση Περισσότερες οδηγίες
Η 1

Αποκτήστε ένα πιάτο για τα κύτταρα . Πλύνετε την πλάκα δύο φορές με 10 χιλιοστόλιτρα PBS ( αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα ) χωρίς ασβέστιο και μαγνήσιο . Προστίθενται 2 ml από detacher ( θρυψίνη ) . Επωάστε την πλάκα για τρία λεπτά στους 37 βαθμούς Κελσίου. Παρατηρούμε την πλάκα κάτω από το μικροσκόπιο για να εξασφαλισθεί ότι τα κύτταρα έχουν αποκολληθεί. Κινούνται απαλά την πλάκα για να αποκολληθούν όλα τα κύτταρα από το κάτω μέρος της πλάκας . Προστίθενται 10 ml ΗΕΚ ( ανθρώπινων επιδερμικών keratinocyctes ) και FCS μέσο ( ορό εμβρύου αγελάδας ) . Χρησιμοποιήστε ένα σιφώνιο 10 ml, για να μετακινήσετε τα κελιά προς τα επάνω και προς τα κάτω . 2

Παρατηρήστε τα κύτταρα κάτω από το μικροσκόπιο για να εξασφαλιστεί ότι είναι μεμονωμένα κύτταρα . Με τη βοήθεια σιφωνίου με το σιφώνιο 10 ml, μέχρι τα κύτταρα να είναι ενιαία , αν χρειαστεί . Φυγοκεντρήστε τα κύτταρα για δύο λεπτά στις 1000 περιστροφές ανά λεπτό . Απορρίψτε το υπερκείμενο . Τοποθετήστε τα κύτταρα σε 10 χιλιοστόλιτρα ορό εμβρύου μόσχου . Φυγοκεντρήστε τα κύτταρα και πάλι για δύο λεπτά στις 1000 περιστροφές ανά λεπτό . Απορρίψτε το υπερκείμενο . Τοποθετήστε τα κύτταρα σε 200 μικρολίτρα εξωτερικό διάλυμα καταγραφής. Παρατηρήστε τα κύτταρα κάτω από το μικροσκόπιο για μεμονωμένα κύτταρα με μια ομαλή μεμβράνη .
Εικόνων 3

Τοποθετήστε το αλατούχο διάλυμα μέσα σε ένα chip σφιγκτήρα patch . Προσθέστε μια σταγόνα του ενδοκυτταρικού διαλύματος ηλεκτρολύτη στο κάτω μέρος του τσιπ χρησιμοποιώντας μία πιπέτα . Τοποθετήστε το τσιπ σε ένα βιδωτό πώμα . Το βιδωτό πώμα θα πρέπει να περιέχει το ηλεκτρόδιο αναφοράς και τη γραμμή αναρρόφησης. Προσθέστε μια σταγόνα εξωκυτταρικό διάλυμα ηλεκτρολύτη προς την κορυφή του τσιπ χρησιμοποιώντας μία πιπέτα . Το διάλυμα ηλεκτρολύτη επιτρέπει για το τσιπ για να κάνουν επαφή με το ηλεκτρόδιο . Προσθήκη 5 μικρολίτρα του κυτταρικού εναιωρήματος σε αλατούχο διάλυμα στο τσιπ . Τοποθετήστε ένα μόνο κύτταρο χρησιμοποιώντας αναρρόφηση μέσω ενός σιφωνίου . Αναρρόφησης μπορεί να πραγματοποιηθεί με το χέρι με αναρρόφηση αέρα διαμέσου του σιφωνίου . Τοποθέτηση του αντίσταση αυξάνεται κυττάρου για να σχηματίσει μία σφράγιση . Η σφραγίδα επιτρέπει την έρευνα ολόκληρου του κυττάρου .
Η
εικόνων