Πώς να βαθμονομείται Gel Διήθηση Στήλες

Οι στήλες διήθησης πηκτής που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό πρωτεϊνών από πολύπλοκα μίγματα . Δεδομένου ότι κάθε πρωτεΐνη έχει ένα μοναδικό μοριακό βάρος , μπορούν να επαχθούν για να διαχωριστεί σε διακριτές στοιβάδες με τη μετανάστευση τους μέσω στήλης διήθησης που περιέχει μία ομοιόμορφα κατανεμημένη μήτρα γέλης . Για να προσδιοριστούν σωστά κάθε πρωτεΐνη που διαχωρίζεται , θα χρειαστεί να ρυθμίσετε τις στήλες χρησιμοποιώντας διάφορες πρωτεΐνες γνωστού μοριακού weight.Things Θα πρέπει
ανθρακικής ανυδράσης
Cytochrome C
Aprotinin
Βασικό άλας
Φυγόκεντρος σωλήνες
αντλία φερριτίνης
Φυγόκεντρος
Pipet
250 ml ογκομετρικό κύλινδρο
Buffer υγρό
επιστημονική μαντηλάκια καθαρισμού
Σύριγγα βαρέλι
Η Εμφάνιση Περισσότερες οδηγίες
Φτηνές 1

Αφαιρέστε τα φιαλίδια της καρβονικής ανυδράσης , κυτοχρώματος C και απροτινίνης από το ψυγείο ή στην κατάψυξη και να μπορέσουν να φτάσουν σε θερμοκρασία δωματίου . Προσθήκη 4 mg κάθε πρωτεΐνης σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης ανά χιλιοστόλιτρο του πηκτώματος στη στήλη διήθησης. Προσθήκη 961 mcl της βασικής άλατος ανά χιλιοστόγραμμο πρωτεΐνης σε κάθε σωλήνα φυγοκέντρησης για να διαλυθούν οι πρωτεΐνες. Προσθήκη 39.2 mcl της φερριτίνης ανά χιλιοστόλιτρο γέλης σε κάθε σωλήνα και στη συνέχεια αναμείξτε σε μια φυγόκεντρο . 2

Απενεργοποιήστε την αντλία στήλη διήθησης και να κλείσει τη στρόφιγγα στην είσοδο της στήλης . Ξεβιδώστε , αλλά δεν επιτρέπεται η αφαίρεση , η κορυφή της στήλης διήθησης . Ρυθμίστε την αντλία με το μέγιστο ρυθμό ροής για τη στήλη και να επανεκκινήσετε την αντλία μέχρι το buffer υλικό έχει συνταχθεί μακριά . Σταματήστε την αντλία .
Εικόνων 3

Προσθέστε 1 ml κάθε πρωτεΐνης στη στήλη διήθησης χρησιμοποιώντας μια αντλία πιπέτα . Στάξει τις πρωτεΐνες κάτω από το εσωτερικό της στήλης από ύψος 1 cm έως 2 cm , που εργάζονται γύρω από την εσωτερική άκρη της στήλης. Αφήνουμε το μείγμα πρωτεϊνών για να εγκατασταθούν στην κορυφή της μήτρας γέλης .
Η

4 Τοποθετήστε τον εύκαμπτο σωλήνα εξόδου της αντλίας σε ένα καθαρό, στεγνό 250 ml διαβαθμισμένο κύλινδρο . Επανεκκινήσετε την αντλία με ρυθμό 0,30 ml ανά λεπτό και να τρέξει τις πρωτεΐνες μέσα στην μήτρα πηκτώματος . Ενώ η αντλία λειτουργεί , ξεπλύνετε τις πλευρές του σωλήνα με τη χρήση της αντλίας πιπέτα και μία μικρή ποσότητα του ρυθμιστικού υγρού. Μόλις οι πρωτεΐνες έχουν εισέλθει πλήρως την μήτρα πηκτώματος , να μειώσει την ταχύτητα της αντλίας έως 0,02 ml ανά λεπτό και η αντλία σε 5 cm έως 7 εκατοστά στρώμα του ρυθμιστικού υγρού στην κορυφή της μήτρας .
5

Αποσυνδέστε το στήλη καπάκι από τη στρόφιγγα . Καθαρίστε το καπάκι της στήλης και το εσωτερικό της στήλης με τη χρήση επιστημονικών μαντηλάκια καθαρισμού . Τοποθετήστε ξανά το καπάκι της στήλης . Γεμίστε τη δεξαμενή με ρυθμιστικό υγρό. Συνδέστε έναν κύλινδρο της σύριγγας από τη βρύση και να το ανοίξετε . Χρησιμοποιήσετε τη σύριγγα να συντάξει μία μικρή ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος διαμέσου της σωλήνωσης και εντός της σύριγγας . Κλείστε τη στρόφιγγα και συνδέστε τον ξανά στην κορυφή της στήλης . Ανοίγετε τη βρύση και ελέγξτε για διαρροές .
Η 6

Εκτελέστε τη στήλη σε 0,02 ml ανά λεπτό για αρκετές ημέρες , μέχρις ότου η ζώνη φερριτίνης πλησιάζει στο τέλος της στήλης . Συλλέξτε όλα τα τζελ φιλτραρίσματος που αντλείται από το ογκομετρικό κύλινδρο .
Η
εικόνων