ΤΟΡΟ Κλωνοποίηση Πρωτόκολλα

κλωνοποίησης ΤΟΡΟ είναι μια διαδικασία κλωνοποίησης που χρησιμοποιεί , γενικά , 3 ' Α υπολείμματα που είναι θερμοδυναμικά ασταθή και συνδυάζει τους με ένα Taq DNA πολυμεράση . Επιπλέον, η μέθοδος χρησιμοποιεί ένα φρέσκο ​​προϊόν αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ( PCR ) που πρέπει να αποθηκεύονται στους 4 βαθμούς Κελσίου . Αυτή η μορφή της κλωνοποίησης βελτιστοποιεί το δραστικό τοποϊσομεράσης Ι μόριο που προστίθεται στο τέλος ενός γραμμικού φορέα. Για να εκτελέσετε κλωνοποίησης ΤΟΡΟ , ένα ορισμένο πρωτόκολλο πρέπει να ακολουθείται . Προετοιμασία
Η

Μπορούν να ληφθούν ορισμένα βασικά βήματα για να επιταχυνθεί η συνολική διαδικασία ΤΟΠΟ κλωνοποίηση και να διασφαλίσουν την επιτυχία της . Πρώτον , σωλήνες των βιώσιμων κυττάρων θα πρέπει να τοποθετείται σε πάγο για να διατηρηθεί η αποδοχή τους . Στη συνέχεια , ο σούπερ βέλτιστη πολιτισμός ( SOC ) μέσο , την ανάπτυξη βακτηριδίων εμπλουτισμένο με θρεπτικά συστατικά , θα πρέπει να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου . Οι επιλεκτικές πλάκες θα πρέπει στη συνέχεια να προ - θερμαίνεται στους 37 βαθμούς Κελσίου , έτσι ώστε να είναι απόλυτα έτοιμοι όταν έρχεται η ώρα να τα χρησιμοποιήσετε .
Εικόνων Συνδυάζοντας Συστατικά
Η

Για να ξεκινήσετε την κλωνοποίηση διαδικασία , ένας συνδυασμός από 2 μικρόλιτρα αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης ( PCR) προϊόν , 0.5 μικρολίτρα του διαλύματος άλατος , και 0.5 μικρολίτρα του φορέα κλωνοποίησης θα πρέπει να συνδυάζονται σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης 0,5 - χιλιοστόλιτρο . Αφού συνδυαστούν , αυτά τα συστατικά θα πρέπει να τεθούν σε θερμοκρασία δωματίου και αφέθηκε να επωαστεί για πέντε έως δέκα λεπτά . Στη συνέχεια, τα συνδυασμένα συστατικά θα προστεθούν στο "Top - 10 χημικώς ικανών κυττάρων " σε ένα σωλήνα 50 - μικρολίτρων και τοποθετήθηκε σε πάγο για επιπλέον δέκα λεπτά. Μετά από αυτό , τα κύτταρα πρέπει να θερμικό σοκ στους 42 βαθμός Κελσίου ακριβώς και τοποθετήθηκε σε πάγο για ένα επιπλέον λεπτό πριν από 180 μικρολίτρα του μέσου SOC προστίθεται . Αυτό το μείγμα θα πρέπει στη συνέχεια να ανακινείται σε μια οριζόντια κατεύθυνση σε 200 rpm για μια επιπλέον ώρα στους 37 βαθμούς Κελσίου . Εικόνων
Final Steps
Η

Ένα μίγμα 50 μΐ και 100 μικρολίτρα από κάθε αντίδραση πρέπει να επιστρώνονται έξω » πάνω σε LB + ΑΜΡ πλάκες + X - Gal και επωάζεται χωρίς ανακίνηση όλη τη νύχτα στους 37 C. " Την επόμενη ημέρα οι τρεις λευκές αποικίες από κάθε αντίδραση πρέπει να συλλέγονται και τοποθετούνται σε 4 ml LB + ΑΜΡ και αφήνεται να επωασθεί επί μία νύκτα σε μία θερμοκρασία από 37 βαθμούς Κελσίου ενώ ανακινήθηκε στις 200 στροφές ανά λεπτό . Το τελικό βήμα είναι η μίνι - προετοιμασία των πλασμιδίων και περιμένουν να δουν αν η διαδικασία ήταν επιτυχής .
Εικόνων